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本试剂盒适用于快速提取植物组织细胞总RNA，是在无苯酚、氯仿RNA快速提取技术基础上，增加的基因组DNA清除柱可以有效清除gDNA残留，得到的RNA一般不需要DNase消化，可用于反转录PCR、荧光定量PCR等实验。独特的裂解液迅速裂解细胞和灭活细胞RNA酶，离心沉淀去除多糖多酚和次级代谢产物，然后裂解混合物用乙醇调节RNA结合吸附到基因组DNA清除柱，然后RNA被选择性洗脱滤过，吸附在基因组DNA清除柱上的残留DNA无法洗脱连同柱子一起丢弃从而清除掉DNA。滤过的RNA用乙醇调节结合条件后，RNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜，再通过一系列快速的漂洗-离心的步骤，去蛋白液和漂洗液将细胞代谢物，蛋白等杂质去除，最后低盐的RNase-free H20将纯净RNA从硅基质膜上洗脱。

• 完全不使用有毒的苯酚，氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤。
  
• 简捷，单个样品操作一般可在25分钟内完成，世界上最简单快速的试剂盒。
  
• 独特研发成功基因组DNA清除柱技术可以有效清除gDNA残留，得到的RNA一般不需要DNase消化，可用于反转录PCR、荧光定量PCR等实验。
  
• 世界领先适应性极其广泛，可以提取包括复杂中草药如石斛/丹参/雪莲/人参、复杂淀粉种子如水稻/小麦/玉米种子、复杂果实如葡萄/蓝莓/草莓/西瓜果实、复杂抗逆植物如冬青/松针/沙棘/胡杨、复杂花卉月季/玫瑰/梅/牡丹花、复杂多糖植物紫菜/仙人掌/芦荟/百合鳞茎/水稻种子等数百种国内外试剂盒提取失败的样品。
  
• 多次柱漂洗确保高纯度，OD260/OD280典型的比值高达2.1～2.2，基本无DNA残留，可用于RT-PCR，Northern-blot，二代测序和各种实验。

• 不合适的储存于低温（4℃或-20℃）会造成溶液沉淀，影响使用效果，因此运输和储存均在室温下（15～25℃）进行。
  
• 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。

• 所有的离心步骤均可在室温完成（4℃离心也可以），使用转速可以达到13000rpm的传统台式离心机，如Eppendorf 5415C或者类似离心机。
  
• 第一次使用前请先在漂洗液RW瓶加入指定量无水乙醇!
  
• 需要自备β-巯基乙醇，乙醇，研钵(可选)。
  
• 样品处理量绝对不要超过基因组清除柱DA和和RNA吸附柱RA处理能力，否则造成DNA残留或产量降低。开始摸索实验条件时，如果不清楚样品DNA/RNA含量时可使用较少的样品处理量，将来根据样品试验情况增加或者减少处理量。
  
• 裂解液CLB和RLT Plus和去蛋白液RW1中含有刺激性化合物，操作时戴乳胶手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。
  
• 关于DNA的微量残留：一般说来任何总RNA提取试剂在提取过程中无法完全避免DNA的微量残留（DNase消化也无法做到100%无残留），本试剂盒采用独特的缓冲体系和基因组DNA清除柱技术，绝大多数DNA已经被清除，不需要DNase消化，可直接用于反转录PCR和荧光定量PCR。个别特殊情况如DNA含量过于丰富造成残留或者要进行严格的mRNA表达量分析荧光定量PCR，我们建议在进行模板和引物的选择时注意以下几点。
  
  • 选用跨内含子的引物，以穿过mRNA中的连接区，这样DNA就不能作为模板参与扩增反应。
    
  • 选择基因组DNA和cDNA上扩增的产物大小不一样的引物对。
    
  • 将RNA提取物用RNase-free的DNase I处理。本试剂盒还可以用于DNase I处理后的RNA清洁，请联系我们索取具体操作说明书。
    
  • 在步骤去蛋白液RW1漂洗前，直接在吸附柱RA上进行DNase I柱上消化处理。购买微量DNA柱式吸附清除试剂盒前可先索取具体操作说明书。

• 直接研磨法：
  实验室无液氮情况下或者柔软易研磨植物样品推荐此法。
  
  • 新鲜植物组织或者冰冻保存样品称重后取100mg～200mg（水分少的样品如叶片种子等可加100mg～150mg，水分多的样品如草莓西瓜果实可多加一些）迅速剪成小块放入研钵，加入1mL CLB（请确保已加有β-巯基乙醇）室温下充分研磨成匀浆，注意应该迅速研磨让组织和裂解液CLB立刻充分接触以抑制RNA酶活性。
    
    • β-巯基乙醇是裂解液CLB的关键成分，必要的时候可以提高终浓度到10～20%。
      
    • 如果特别复杂植物，可以尝试在裂解液中加入PVP40至终浓度2%。
  • 将裂解物转入离心管，立即剧烈振荡15秒，短时放回65℃水浴中（5～10min），中间偶尔颠倒1～2次帮助裂解。13000rpm离心10分钟，沉淀不能裂解的碎片。
    
  • 取裂解物上清（在不超过基因组DNA清除柱能力的情况下可以取更多的上清，这样可以提高产量）转到一个新离心管。加入上清体积一半的无水乙醇(0.5体积)，此时可能出现沉淀，但是不影响提取过程，立即吹打混匀，不要离心。
    
    • 若上清表面有漂浮物，用吸头挑开吸取下面液体即可。
  • 立刻接操作步骤的步骤3。
• 液氮研磨法：
  适用广泛，提取复杂难破碎，易降解样品时推荐此法。
  
  • 液氮中研磨新鲜或-70℃冷冻的材料至细粉。
    
  • 转移100mg～200mg细粉（水分少的样品如叶片种子等可加100mg～150mg，水分多的样品如草莓西瓜果实可多加一些）加至预热的裂解液CLB（已加有β-巯基乙醇）离心管中。立即剧烈涡旋30～60秒或者用吸头吹打混匀裂解直得到满意匀浆结果(或者电动匀浆30秒)，可以剪切DNA，降低粘稠度和提高产量。
    
  • 短时放回65℃水浴中（5～10min），中间偶尔颠倒1～2次帮助裂解。
    
  • 将裂解物13000rpm离心10分钟，沉淀不能裂解的碎片。
    
  • 取裂解物上清（在不超过基因组DNA清除柱能力的情况下可以取更多的上清，这样可以提高产量）转到一个新离心管。加入上清体积一半的无水乙醇(0.5体积)，此时可能出现沉淀，但是不影响提取过程，立即吹打混匀，不要离心。
    
    • 若上清表面有漂浮物，用吸头挑开吸取下面液体即可。
  • 立刻接操作步骤的步骤3。
• 将混合物(每次小于720μL，多可以分两次加入)加入一个基因组清除柱中，（清除柱放入收集管中）13000rpm离心2分钟，弃掉废液。
  
  • 确保离心后液体全部滤过去，膜上没有残留，如有必要，可以加大离心力和离心时间。
• 将基因组DNA清除柱子放在一个干净2mL离心管内（不用RNAse free或者DEPC处理，一般干净的新离心管即可。也可使用RNA吸附柱配套的新的干净收集管），在基因组清除柱内加500μL裂解液RLT Plus，13000rpm离心30秒，收集滤液（RNA在滤液中），用微量移液器较精确估计滤过液体积（通常为450～500μL左右，滤过时候损失体积应该减去），加入0.5倍体积的无水乙醇，此时可能出现沉淀，但是不影响提取过程，立即吹打混匀，不要离心。
  
• 立刻将混合物(每次小于720μL，多可以分两次加入)加入一个吸附柱RA中，（吸附柱放入收集管中）13000rpm离心2分钟，弃掉废液。
  
  • 确保离心后液体全部滤过去，膜上没有残留，如有必要，可以加大离心力和离心时间。
• 加700μL去蛋白液RW1，室温放置1分钟，13000rpm离心30秒，弃掉废液。
  
• 加入500μL漂洗液RW（请先检查是否已加入无水乙醇!），13000rpm离心30秒，弃掉废液。加入500μL漂洗液RW，重复一遍。
  
• 将吸附柱RA放回空收集管中，13000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
  
• 取出吸附柱RA，放入一个RNase free离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加30～50μL RNase-free water（事先在70～90℃水浴中加热可提高产量），室温放置1分钟，12000rpm离心1分钟。
  
• 如果预期RNA产量>30μg，加30～50μL RNase-free water重复步骤9，合并两次洗液，或者使用第一次的洗脱液加回到吸附柱重复步骤一遍(如果需要RNA浓度高)。
  
  • 洗脱两遍的RNA洗脱液浓度高，分两次洗脱合并洗脱液的RNA产量比前者高15～30%，但是浓度要低，用户根据需要选择。

• 按照前面所列RN53试剂盒操作步骤操作，直到做完操作步骤5。
  
• 取45μL DNase I buffer和5μL RNase free DNase I在离心管轻轻吹打混匀成工作液（处理多个离心柱子要按照比例放大制备工作液）。
  
• 向吸附柱RA中加入350μL去蛋白液RW1，12000rpm离心30秒，弃废液，将吸附柱放回收集管中。
  
• 向吸附柱RA中央加入50μL的DNase I工作液，室温（20℃～30℃）放置15分钟。
  
  • 直接将工作液滴在膜中央上向膜四周浸润充分和膜接触，不要让工作液滴在O型垫圈或是离心柱管壁上挂壁或者挂在垫圈上不能充分和膜接触。
• 向吸附柱RA中加入350μL去蛋白液RW1，12000rpm离心30～60秒，弃废液，将吸附柱放回收集管中。
  
• 接着做操作步骤7，并完成后续所有步骤。